dPCR技术是继实时PCR技术之后的第三代PCR技术，具有超高灵敏度的特点。由于不需要标准品，通过泊松分布的统计计算就可以实现绝对定量，这就是所谓的数字PCR技术。

1:样品制备

       与所有基因组分析一样，必须获得核酸样本。对于基因分型应用，有必要从靶组织或样品中纯化基因组DNA(gDNA)样品。对于基因表达分析，需要分离目标mRNA，并通过逆转录酶分析将其转化为cDNA。和qPCR一样，dPCR使用耐热的DNA聚合酶来扩增靶DNA，所以不能直接扩增RNA。

      获得纯化的gDNA或cDNA后，将样品与正向和反向引物以及水解探针混合，水解引物被设计成具有与靶基因/DNA互补的序列。引物与靶序列的外部区域退火，这与典型的PCR反应相同。5’核酸酶(水解)探针在正向引物和反向引物之间退火。水解探针包括5’荧光团和3’淬灭剂。与传统的qPCR分析一样，引物和探针的设计是获得准确结果的关键。由于数字PCR检测和qPCR检测的设计相似，引物探针的设计原理基本相同，但dPCR对引物特异性的要求更高。

    也可以用SYBR或EvaGreen包埋的双链DNA染料来检测数字PCR，而不是5’核酸探针。

2:dPCR反应溶液的分配

     虽然数字PCR反应系统与qPCR相同，但数据生成阶段不同。dPCR分析首先将反应分成数万个纳升的反应，因此每个分区中有1或0个目标DNA分子。不同厂商实现分区的方式不同。在一些dPCR平台中，反应被分成单个微孔，而另一些则以油/水乳液的形式产生纳升大小的反应液滴。dPCR不能像qPCR一样实时分析单个扩增反应，而是使用终点检测方法来检测超过10000个单独的PCR反应。

3: PCR扩增和终点检测

      分区后，通过常规PCR循环参数扩增微分区中的模板DNA。当DNA聚合酶在循环从正向引物延伸时，其核酸外切酶活性将降解探针，从而释放5’荧光团，然后释放可检测的荧光。如果分析包括插入染料而不是水解探针，荧光将随着双链PCR扩增子的积累而增加。

      在PCR循环完成后，任何含有一个模板或靶DNA序列的分区都将发出荧光。任何缺少目标DNA的液滴或孔都不会发出荧光。带有荧光的液滴或孔的总数代表样品中目标分子的总数。从统计学上讲，一些区域可能有一个以上的靶DNA，这可以通过应用泊松分布函数来校正，以确定样品中靶分子的总数。

      影响数字PCR实验成败的因素很多，包括操作方法、引物探针的特异性、退火温度、引物探针的浓度、核酸模板的浓度、PCR反应液的配置等。由于分区原理不同，不同的dPCR平台可能有自己的操作细节。这里主要介绍操作方法之外的影响因素。

因素1:引物探针特异性

      dPCR和qPCR的原理相同，染料法和Taqman探针法都可以用来检测荧光信号，所以对dPCR引物探针特异性的设计要求基本相同。但由于dPCR是在1nl(纳升)的反应体系中扩增的，所以这个体系中一般只有一个模板分子，需要引物和探针的高度特异性才能与模板结合。因此，设计dPCR引物探针时要注意:扩增产物长度建议为60-120 BP；上游和下游引物之间的退火温度差<1℃；对于Taqman探针法，建议使用双淬灭探针，尤其是当dPCR检测背景过高，干扰样本检测的准确性；建议探针修饰荧光基团的位置不要有G碱基，G碱基会淬灭荧光信号。

因素2:退火温度

      dPCR对引物探针的特异性要求较高，因此在扩增过程中也需要较高的退火温度。一般qPCR的退火温度是引物的Tm值减去2-3℃。然而，为了确定dPCR的退火温度，需要梯度退火来选择最合适的退火温度。当然qPCR的退火温度减去3-5℃也可以作为dPCR的退火温度。如果结果不稳定，重复性差，仍需梯度退火筛选最佳退火温度。总之，dPCR技术对退火温度比较敏感，需要选择最佳的退火温度，一般低于qPCR退火温度。

      一般qPCR的退火时间为15-30秒，但数字PCR的退火时间更长，一般为45-90秒。主要原因是在数字PCR反应体系中加入了一些油(不同的平台油作用不同)，导致数字PCR反应体系庞大，需要较长的退火时间来保证引物/探针与模板的结合。

    此外，还需要注意数字化PCR反应系统中的荧光信号，在PCR扩增过程中要设计升温和降温速率，一般为1-2℃/s，一般为2℃/s。

因素3:模板浓度

     qPCR检测的动态范围一般为10-107copies/ul，对应的ct值范围为15-35。但dPCR的动态范围略小，一般为1-104copies/ul。而dPCR的检测线明显低于qPCR，可以准确检测单拷贝基因。因此，dPCR更适合检测低拷贝数的基因。当然，拷贝数高的基因是可以稀释检测的。因此，样品的初始浓度对dPCR有很大的影响。样本浓度过高，超过了dPCR检测线，导致检测不准确，需要评估样本的初始拷贝数。样本初始拷贝数的评估可分为两类:

质粒初始拷贝数的评估

      质粒的初始拷贝数可以通过质粒浓度和质粒大小来计算。比如一个质粒的大小是5000bp，紫外分光光度计测得的浓度是50ng/ul。将两个参数带入计算公式，计算出质粒的理论拷贝数为9.26×10^9拷贝/ul，因此需要将质粒稀释至少10^6倍，然后用dPCR检测。

样本初始拷贝数的评估

      为了保证样本的初始拷贝数在dPCR的动态检测范围内，只能通过其他方法(如qPCR)或多次dPCR梯度稀释实验进行验证。对于dPCR梯度稀释实验，先对样品进行梯度稀释，然后选择能够用dPCR准确检测结果的浓度。对于qPCR评价，主要通过qPCR的ct值来评价样本的大概拷贝数。以下是ct值与分子数的对应关系(此对应关系为近似值)。

引物探针的浓度

      当数字PCR检测到的背景荧光信号过高时，无法区分阳性信号和背景信号。如果是染料法实验，可以考虑降低引物浓度来下调背景荧光信号。如果是Taqman探针法实验，可以考虑降低探针浓度来降低背景信号。当然，你也可以使用双猝灭探针来降低背景信号。双淬灭探针不仅可以降低背景信号，还可以提高探针对模板的灵敏度。双猝灭探针在国内可以自主合成。通常，dPCR反应体系中引物和探针的最终浓度在100-400nM之间。根据我们的经验，数字PCR反应系统中引物和探针的最终浓度在200nM左右，适用于大多数项目。

dPCR反应溶液的配置

      对于dPCR，qPCR的样品制备方法与之完全相同，但需要注意的是，如果dPCR存在重复孔，则需要将重复孔的不同反应液分配到同一个PCR管中。最后，装样时，要分别取样送至dPCR系统，也要吹扫混匀。由于dPCR的高灵敏度，如果样品配置不均匀，会导致重孔差异较大(这种情况是操作失误造成的)。

      实时荧光定量PCR可用于绝对定量和相对定量，其中绝对定量是用一系列已知浓度的标准样品制作标准曲线。在相同条件下，将目标基因的荧光信号与标准曲线进行比较，从而获得目标基因的量。可选择体外合成的纯化质粒DNA或ssDNA作为标准样品，相对定量可通过内参转换。

      数字PCR是在传统PCR和实时荧光定量PCR基础上发展起来的第三代PCR技术。无需标准品和标准曲线，可实现更灵敏、准确的绝对定量。同时，数字PCR是一种单分子扩增技术，可以有效避免反应抑制剂的影响。随着反应室的增大，反应受抑制剂的影响越来越小。